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组织切片免疫染色技术的操作方法分析

阅读次数：1252 发布时间：2013/8/6 9:37:34

组织切片免疫染色技术的操作方法分析

一、组织切片免疫染色过程

组织切片免疫染色技术可分为3个步骤：①组织的制备和切片；②样本与抗体结合；③检测。

样本被固定到载玻片上后，加特异性抗体与其相应的抗原结合，没有结合的抗体则被洗掉；再加标记的相应二抗，与一抗发生特异性反应；冲洗后，抗原的位置可以通过检测标记的二抗而得知。

二、组织标本的制备

免疫染色的组织材料主要有两种来源。首先，研究者可以自己收集、固定标本，这样所有的步骤都可以优化。尽管如此，但大多研究者还是希望实验的组织材料是在病理室贮存的或在其他贮藏器内贮存的材料。这些标本常以石蜡包埋块贮存，来源于组织化学分析以及抗原分析的有关信息极为重要。但是应该认识到这些样品的收集存在以下的问题：①固定的时间和条件很难标准化；②固定液、贮存条件及贮存时间不同。在这种情况下，有些抗原、抗体结合的结果意义不大，因其对不同的固定不很敏感，对另外一些检测也许很有意义。

目前贮存收集的样本常常是速冻组织，这是免疫染色有价值材料的来源。但是也很难标准化，且组织化学信息资源有限。冷冻切片所得的标本可与多数来源的抗体较好地发生反应。以下分别介绍制备组织标本的主要方法。这里不涉及如何使用不同型号的切片机和恒冷箱切片机进行组织切片，因其操作方法差异很大。

三、结合

一旦组织被固定并有良好的透过性，就可以加入抗体。与其他许多免疫化学技术一样，可以直接标记一抗，或者通过使用标记的二抗，再与一抗特异结合进行检测。一般情况，直接标记的一抗可以形成较低背景的清晰信号，直接检测的主要缺点是一抗的标记和纯化的准备费时，这使得直接检测用于组织免疫染色更加困难。除特殊情况外，推荐采用商业来源的各种标记的二级试剂进行间接检测。

间接检测时一些试剂可以与一抗特异性结合，发挥桥连作用，这些试剂包括抗免疫球蛋白抗体，蛋白A或蛋白G，或者一抗用生物素、链霉亲和素标记。间接标记的主要优点是一种标记试剂可以用于多种一抗的检测。间接检测方法一般可得到较强的信号，但背景较高。因此，必须设置适当的对照。

组织免疫染色的检测试剂常常用酶标记或者用胶体金标记。依据实验设计不同，不同的标记物各有其优缺点。

组织、器官免疫染色检测方法

方法	优点	缺点	推荐应用
荧光染色	高分辨率，可以双标记	要求特殊显微镜，经过一定时间褪色，易发生荧光猝灭	高分辨率研究，可双标记，酵母菌和虫体染色用此法
酶	高敏感性，只需普通光学显微镜，持久	分辨率低，受内源性酶活性干扰，一些底物有毒性，难于双染色	低分辨率的研究，快速检测抗原
胶体金	高分辨率，可双标记，只需光学显微镜	尚未广泛使用，缺乏经验	组织染色较好的替代方法

四、检测

在组织免疫染色中有两种方法常用于标记检测试剂，即酶和胶体金标记。酶标抗体特别适用于敏感抗原的检测，并且只要求一种相应的底物和使用普通的光学显微镜检查。重要的是还可以进行经典组织学中常用的复染。金标试剂是可在光学显微镜水平进行检测的一种相对较新颖的试剂，但在过去，只广泛应用于电子显微镜。当金标试剂和银增强剂并用，则更有独特的优点。

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