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阅读次数:1663 发布时间:2012/9/27 13:48:11
磷酸化的底物
史葛·艾伯林,N维库马尔,和迈克尔J韦伯
微生物学系和癌症中心,弗吉尼亚大学卫生系统,夏洛茨维尔,弗吉尼亚州22908
摘自蛋白质:蛋白质相互作用,第二版
编辑golemis和彼得·亚当斯·A。
摘要
理想的情况下,人们希望能够直接磷酸化的基板在一个完整的细胞。这可能是通过引入到居住或透细胞三磷酸腺苷的模拟。然而,细胞是不透水的三磷酸腺苷,并增加标记的三磷酸腺苷模拟毛地黄皂苷-透细胞结果的水解三磷酸腺苷的模拟1分钟内(乔杜里等人。2002。因此,我们选择了应用此技术的细胞裂解物或分数。在这里,我们描述的方法直接检测基板的蛋白质激酶。种办法涉及确定激酶基板immunoprecipitating标签的形式突变激酶转染COS - 1细胞,并执行一个激酶反应增加γ- [标记]三磷酸腺苷的模拟。第二中方法涉及除重组突变激酶和γ- [标记]三磷酸腺苷模拟细胞裂解液。我们使用这些技术的磷酸化ERK 2基板;然而,这种方法可以适用于其他蛋白激酶。
材料(方法Ⅰ和Ⅱ,如上)
缓冲器,解决方案,和试剂
重组激酶(Ⅱ)
[γ- 32 ]三磷酸腺苷的模拟(Ⅰ+Ⅱ)
时凝胶琼脂糖珠(我)
脂质体转染(我)
激动剂(我),例如,表皮生长因子,血清,血小板衍生生长因子
国旗平方米琼脂糖珠(我)
十二烷基硫酸钠,20%(我)
平方米裂解缓冲液(二)(见议定书1)
公共电视网,室温(我)和冰冷的(Ⅰ+Ⅱ)(见议定书1)
无血清培养基(我,例如,贝科的介质)
旗肽(5毫克/毫升的低渗裂解缓冲液)(我)
激酶缓冲区含有脒,10毫米和100毫米氯化钠(二)
2 Laemm li样品缓冲(我)
低渗裂解缓冲液(我)
20毫米复(7.4)
2毫米钙
2毫米氯化镁
细胞的
1细胞(Ⅰ+Ⅱ)
质粒
maxi-prep DNA质粒携带的抗原表位标记版本的野生型和突变形式的激酶的兴趣(我)
特殊设备
组织培养皿(Ⅰ+Ⅱ)
皮下注射针头的1 / 4,1 ',27计(我)
提取柱(我)
透析盒,10000分子量截止(Ⅱ)
SDS -聚丙烯酰胺凝胶(我)
旋转,设置在冷藏室(4°丙)(我)
沸水浴,预设100°丙(我)
孵化器,预设37°℃,5%二氧化碳(Ⅰ+Ⅱ)
孵化器,预设30°丙(Ⅰ+Ⅱ)
离心冷却到4摄氏°(Ⅰ+Ⅱ)
方法
方法:磷酸化激酶底物
重要的是规范的程序在小型反应之前,扩大程序识别新型基板。
1×106到100毫米1细胞组织培养菜的前1天转染。培养细胞在37摄氏°5%二氧化碳。转染的细胞与6µ克质粒携带抗原表位标记版本的野生型或突变形式的激酶的兴趣,和24µ升的脂质体转染,根据制造商的指示。
24至72小时posttransfection洗两次,细胞与室温硫化铅和serum-starve他们在无血清培养基的4 - 12小时。然后,刺激细胞激动剂5 - 10分钟。
这取决于激酶正在研究,不同饥饿时间和兴奋剂可以用。
洗细胞两次冷硫化铅冰。添加低渗裂解缓冲液(0.5毫升/ 100毫米菜)。
低渗裂解缓冲区是用来保护蛋白相互作用与相关蛋白。为确定相互作用基板,形成稳定的协会,平方米裂解缓冲液(见议定书1)或另一个缓冲区与浓度的增加洗涤剂或盐可以用来(哈洛和1999巷)。
刮的细胞一起和他们转移到1.5毫升微量管。不要涡。溶解细胞的15000g在微量离心在20分钟在4°C
转移上清(~ 1毫克蛋白)为新管。保持小等分旁白(20µ克)检查的表达水平的蛋白表达。
洗时凝胶适量的琼脂糖珠(30µ升/样本)与低渗缓冲液和混合flag-m2琼脂糖珠(10µ升/样本),或珠共轭抗体表位标记的另一个选择(~ 1µ克抗体每1毫克的蛋白质裂解液)。
洗混合珠两次在低渗裂解缓冲液,然后将它们添加到裂解制备步骤5(40µ我每样本)免疫。孵化珠在裂解液1 - 2小时在4摄氏°不断旋转。
洗三次免疫沉淀与低渗裂解缓冲液(1毫升每洗每个样品)。决赛后的清洗,吸剩下的几滴缓冲使用1个1 / 4英寸,27衡量针。
执行激酶反应总体积