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阅读次数:1179 发布时间:2012/9/12 10:08:50
本法反应温和,对抗原、抗体免疫活性影响小,已被广泛应用。缺点是标记率较低,一般为20~40%。
1.原理此法是利用乳过氧化物酶(Lactoperoxidase)有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用,生成125I+,并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。
2.方法以标记蛋白质抗原为例。
(1)反应液组成:蛋白质2~5μg溶于磷酸缓冲液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
(2)在室温保温7min;
(3)加入H2O2200ng(10μl);
(4)过7min再加入H2O2(3μl);
(5)保温7min后,加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应;
(6)10min后加入NaI载体溶液1ml ;
(7)按常规方法分离纯化。
3.注意事项
(1)LPO质量好坏,可直接影响标记率,LPO应在使用前新鲜配制,以防酶活性降低。
(2)LPO用量应小于总蛋白质用量的1%,以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。
(3)碘化反应速率分析表明,酶的催化速度很快。
(4)碘化反应在pH4.0~8.5较宽范围内均可进行,*适pH值应依据蛋白质本身性质而定。
(5)H2O2应保持低浓度,如高于0.1mmol/L,对酶的活性将有抑制作用。
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